ایمونواسی یا سنجش ایمنی

ایمونواسی یا سنجش ایمنی

سید امید میراحمدی

کارشناس بخش کنترل کیفی-اپلیکیشن شرکت دانش بنیان آپتاسیس

در ابتدای نیمه دوم قرن بیستم، محصول سیستم ایمنی هومورال یعنی آنتی‌بادی‌ها نقطه عطفی در اندازگیری و شناسایی آنالیت های بیولوژیکی ایجاد کرد. آنتی‌بادی‌ با اتصال ویژه به آنالیتی كه بر ضد آن تهیه شده ‌است به عنوان ابزاری مناسب برای سنجش‌های

ویژه و سریع در اختیار محققان قرار گرفت. روش‌هایی كه از آنتی‌بادی‌ها به عنوان فاكتور شناساگر بهره می‌گیرد، روش‌های سنجش ایمنی یا ایمونواسی نام گرفتند. ابداع این روش به سال ۱۹۵۹ برمی‌گردد.
«Yalow» و «Berson» محققانی بودند كه با استفاده از آنتی‌ژن نشان‌دار (رادیواكتیو) و آنتی‌بادی ویژه، هورمون انسولین را برای اولین بار مورد اندازه گیری قرار دادند. آنها كه در سنجش خود از محصول سیستم ایمنی و رادیواكتیویته استفاده كرده بودند،

درواقع ایمونواسی از تکنیک هایی تشکیل شده است که در آن آنتی بادی و آنتی ژن ابزار سنجش میباشند.

سنجش های ایمنی را میتوان به صورت های مختلف دسته بندی نمود مثلا بر اساس کیفی یا کمی بودن واکنش، نوع نمونه مورد آزمایش که آنتی ژن باشد یا آنتی بادی، نوع ماده نشاندار، رقابتی یا نارقابتی بودن واکنش، انجام واکنش در شرایط تعادلی یا غیر تعادلی و همچنین استفاده از روش دستی یا دستگاهی

یکی از اولین روش های تقسیم بندی صورت گرفته، واکنش ایمنی را به دو گروه واکنش های سنجش ایمنی نشان دار(Labeled Immunoassay) و غیرنشان دار(Nonlabled Immunoassay) تقسیم میکند.

در واکنش های سنجشی نشاندار از برخی مواد رادیواکتیو، لومینسانس، فلورسانس یا آنزیم استفاده میشود که آنتی ژن یا آنتی بادی توسط آنها نشاندار میگردد، این مواد باعث ایجاد سیگنال در واکنش شده که البته قابل تقویت نیز میباشد.

در سنجش های ایمنی غیرنشاندار نیز باید کمپلکس بزرگی از آنتی ژن-آنتی بادی تهیه گردد که این واکنش قابل مشاهده باشد همانند واکنش های رسوبی(Precipitation) و آگلوتیناسیون که جهت بررسی آن میتوان از میکروسکوپ یا استفاده از روش های تفرق نور مانند نفلومتری و توربیدومتری نیز بهره جست. بدیهی ست که حساسیت واکنش های غیرنشاندار از واکنش های نشاندار پایین تر بوده و در حدود میکرومول در لیتر (µMol/L) میباشد.

سنجش های ایمنی نشاندار بر اساس نوع ماده نشاندار اسامی مختلفی دارند مثل؛ واکنش های سنجش رادیوایزوتوپی(Radio Immunoassay) که از مواد رادیواکتیو برای نشاندار کردن استفاده شده یا واکنش های سنجش آنزیمی(Enzyme Immunoassay) که در آنها از آنزیم برای نشاندار شدن استفاده میشود و بالاخره Flurescent Immunoassay و Chemiluminescent Immunoassay که از مواد فلورسانت و لومینسانس برای نشاندار شدن استفاده شده است.

به دلیل قدمت سنجش‌های ایمنی رادیوایزوتوپی ابتدا به شرح مختصر این روش خواهیم پرداخت.

سنجش رادیوایزوتوپی
در واكنش میان آنتی‌ژن و آنتی‌بادی هر كدام از این دو جزء را می‌توان با ماده رادیواكتیو نشاندار ساخت و از لحاظ ردیابی كمپلكس ایجاد شده تفاوتی میان جایگاه اتصال ماده رادیواكتیو وجود ندارد هر چند كه با همین تغییر جایگاه نشاندارسازی برخی از پارامترها دچار تغییر خواهند شد. چنانچه آنتی‌ژن با ماده رادیواكتیو نشاندار شود،سنجش را RIA (Radio Immuno Assy) می‌نامند.

اساس روش RIA رقابت میان آنتی‌ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی‌بادی است. از آنجایی كه در این روش هر قدر میزان آنتی‌ژن موجود در نمونه سنجش بیشتر باشد، آنتی‌ژن رادیواكتیودار كمتری به آنتی بادی متصل می‌شود، میزان كمپلكس رادیواكتیو با آنتی‌ژن غیر رادیواكتیو رابطه معكوس دارد.
 

سنجش‌های ایمنی آنزیمی
اساس این روش‌ها مانند سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو همان واكنش آنتی‌ژن- آنتی‌بادی است، با این تفاوت كه جهت ردیابی واكنش مذكور به جای رادیواكتیویته از آنزیم‌ها و واكنش‌های آنزیمی استفاده می‌شود.
در این روش نیز می‌توان جهت ردیابی واكنش، آنتی‌ژن و یا آنتی‌بادی را با آنزیم نشاندار ساخت. به عمل نشاندارسازی، كونژوگاسیون و به مولكول آنزیم‌دار، كونژوگه آنزیمی می‌گویند.

چنانچه آنتی‌ژن كونژوگه گردد روش EIA (Enzyme Immuno Assay) گویند و اگر آنتی بادی كونژوگه گردد روش را IEMA (Immuno Enzymo Meteric Assay)  گویند.
اساس روش EIA، رقابت میان آنتی‌ژن كونژوگه و آنتی‌ژن آزاد در نمونهی مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی‌بادی است. در اینجا نیز میزان كمپلكس آنزیم‌دار با آنتی‌ژن آزاد رابطه معكوس دارد. لذا می‌توان بسته به نیاز از آنتی‌بادی‌های پلی كلونال یا مونوكلونال استفاده كرد.
البته در برخی سنجش‌ها آنتی‌بادی‌های الیگو كلونال پاسخ بهتری ایجاد می‌كند. (چنانچه چند نوع آنتی‌بادی مونوكلونال را با هم مخلوط كنیم، مجموعه حاصله را آنتی‌بادی الیگوكلونال می‌نامند).
سنجش‌های نشاندار آنزیمی علاوه بر امكان ردیابی، امكان تقویت نیز دارند یعنی واكنش آنزیمی‌،‌ هر آنالیت را به یك كمپلكس آنزیم‌دار و هر آنزیم را به میلیون‌ها تغییر در ماده اولیه یا محصول مرتبط می‌سازد.
از آنجایی كه آنزیم‌های متفاوت، واكنش آنزیمی متفاوت و قابل ردیابی ایجاد می‌كند در یك نمونه می‌توان با استفاده از چند كونژوگه آنزیمی و پیگیری چند فعالیت آنزیمی، چند آنالیت را به طور همزمان مورد سنجش قرار داد. هر چند فراهم آوردن شرایط یكسان برای فعالیت مناسب چند نوع آنزیم كار پیچیده‌ای است اما امكان‌پذیر است و امكان سنجش همزمان سرعت آزمون‌ها و همچنین هزینه آنها را كاهش می‌دهد.
 

سنجش های ایمنی فلورسنتی

یکی از اولین تکنیک هایی که با بهره گیری از خاصیت لومینسانس فلورسنتی مورد استفاده قرار گرفت روش Flourescent Immunoassay بود که هنوز هم به شکل محدود در کارهای سنجشی از آن استفاده میشود؛ این روش حساس تر از روش های جذبی شیمیایی است و برای اندازه گیری هایی که احتیاج بهجداسازی بخش های اتصال یافته از بخش های اتصال نیافته ندارند مناسب است. اما یکی از مشکلات این روش وجود برخی ترکیبات درون محیط واکنش است که دارای حالت فلورسانس خودبخودی میباشند. پروتئین های سرمی در طول موج 320 الی 350 و بیلی روبین در 430 الی 470 نانومتر چنین توانایی هایی ازخود نشان میدهند.

سنجش های ایمنی شیمی نورتابی

هنگامی که یک الکترون از سطح انرژی بالاتر به سطح پایین تر انرژی می رود، انرژی خود را به صورت نور متصاعد می کند، که به آن لومینسانس می گویند. انواع مختلفی از پدیده لومینسانس شناخته شده اند که شامل فلورسانس، فسفرسانس و کمی لومینسانس می باشند.

پدیده کمی لومینسانس از سایر پدیده های لومینسانس متفاوت است و در آن  واکنش شیمیایی باعث بالا رفتن سطح انرژی نمی شود. ولی مشابه فلورسانس بوده و در حین بازگشت الکترون به سطح پایه انرژی، نور منتشر می شود. شدت این نور ها (اصطلاح فوتون ها) به قدری ضعیف است که نه تنها نمی توان با چشم غیر مسلح دید بلکه با هر تجهیزاتی نمی توان آن ها را اندازه گیری کرد. بنابرین می توان به این نتیجه رسید که دستگاه کمی لومینسانس دستگاهی بسیار حساس و دقیقی می باشد که می تواند چنین فوتون هایی را اندازه گیری کند.

کمی لومینسانس (Chemi Luminescence) همانطور که از اسمش مشخص است “پرتاب نور طی واکنش های شیمیایی” می باشد و نسل جدید روش‌های سنجش ایمنی است كه پس از متدهای رادیو ایمونواسی و الایزا به دلیل ویژگی‌هایی از جمله حجم اندك نمونه، افزایش سرعت واكنش و اتوماسیون حاكم بر مراحل انجام آزمون، در تشخیص بیماری‌ها به كار گرفته می‌شود .

منابع:

Enzyme immunoassay techniques An overview T. Porstmann and S.T. Kiessig Department of Medical Immunology, Medical School (CharitY), Humboldt Unit'ersity Berlin, Berlin, Germany

کمی لومینسانس-شهره شرق-انتشارات لحظه

الایزا-واحد تحقیق توسعه شرکت پیشتاز طب-انتشارات میرماه