تست ریکاوری یا بازیابی

دکتر فرشید یگانه

دانشیار ایمونولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی

مشاور علمی‌شرکت دانش بنیان آپادانا تابناک سیستم

در روش‌های ایمونواسی مانند الایزا و کمی‌لومینسنس، اجزای بافر مورد استفاده در ساخت استانداردها، همچنین ماتریکس سرم و پروتئین‌های موجود در آن مانند کمپلمان، فاکتور روماتوئید، آنتی‌بادی‌های هتروفیل و سایر عوامل می‌توانند بر اتصال آنتی‌بادی به آنتی‌ژن در سرم تأثیر بگذارند و بنابراین بر دقت نتایج روش ایمونواسی تأثیر می‌گذارند. به‌ بیان دیگر، در این سنجش‌ها با توجه به این که از استانداردها برای رسم نمودار استاندارد و تعیین غلظت آنالیت استفاده می‌گردد، این خطر وجود دارد که تفاوت بین ماتریکس نمونه سرم و ماتریکس استانداردها بر روی دقت سنجش اثر بگذارد. برای بررسی و تعیین میزان اثر ماتریکس بر دقت سنجش، از آزمون بازیابی (Recovery) و خطی بودن (Linearity) استفاده می‌گردد. بنابراین، آزمایش‌های بازیابی و خطی بودن روش‌های مهمی ‌برای اعتبارسنجی و ارزیابی دقت روش‌های ایمونواسی هستند و  نتایج این آزمایش‌ها با هم مرتبط هستند. در Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI)، استاندارد EP34 به توصیف مفاهیم خطی بودن، بازیابی و شیوه انجام این ارزیابی‌ها می‌پردازد.

یکی از روش‌های انجام تست بازیابی که بسیار رایج است، ارزیابی نمونه‌ای است که آنالیت به آن اضافه شده است (spike recovery). در ارزیابی‌های Spike Recovery، مقدار معینی از آنالیت به یک نمونه سرم افزوده می‌شود و سپس غلظت نهایی با روش ایمونواسی سنجش می‌گردد. نسبت غلظت اندازه‌گیری شده به غلظتی که باید اندازه‌گیری می‌شد، نشان می‌دهد که آیا با استفاده از این کیت می‌توان آنالیت مورد انتظار را به دقت اندازه‌گیری کرد یا خیر. اگر مقدار بازیابی شده به‌طور قابل توجهی با مقدار مورد انتظار متفاوت باشد، نشانه این است که برخی از عوامل در ماتریکس نمونه ممکن است باعث تداخل در اندازه‌گیری و در نتیجه افزایش یا کاهش کاذب مقدار گزارش شده شوند. اگر یک ماتریکس خالی (نمونه‌ای از ماتریکس که مقدار آنالیت‌ در آن صفر است) در دسترس باشد، آنالیت را می‌توان به آن اضافه کرد و درصد بازیابی را تعیین کرد. اگر ماتریکسی خالی از آنالیت در دسترس نباشد، اسپایک را می‌توان به یک سرم معمولی که میزان آنالیت در آن مشخص است اضافه نمود. سپس میزان آنالیت را مجدداً اندازه‌گیری کرده و نسبت میزان اندازه‌گیری شده به میزانی از آنالیت که واقعا در سرم وجود دارد را محاسبه نمود. برای این کار از فرمول زیر استفاده می‌شود:     % Recovery = (Observed Concentration   Expected Concentration )*100

درصورتی‌که آنالیت مورد ارزیابی در سرم به‌صورت خالص و طبیعی در دسترس نباشد، می‌توان از آنالیت سنتتیک استفاده نمود. در مورد پروتئین‌ها، آنالیت سنتتیک می‌تواند پروتئین نوترکیب (Recombinant) باشد. در این حالت به روش ارزیابی اصطلاحاً بازیابی جایگزینی  (Surrogate Recovery) گفته می‌شود. دقت شود در این حالت باید اطمینان حاصل شود که افینیتی آنتی‌بادی برای هر دو آنتی‌ژن طبیعی و سنتتیک یکسان باشد. توجه به این نکته نیز ضروت دارد که مقدار آنالیت افزوده شده باید به اندازه‌ای باشد که ماتریکس سرم تغییر نکند (حداکثر یک دهم حجم سرم). به‌طور مثال اگر حجم نمونه 1 میلی‌لیتر باشد، باید حداکثر 100 میکرولیتر از آنالیت حل شده در بافر را اضافه کرد. در روش‌های ایمونواسی از استانداردها برای افزودن به سرم و انجام تست Spike recovery استفاده می‌شود. مقدار مجاز Recovery بین95% و 105% است که در این صورت مقدار Bias برابر با  5% ±  در نظر گرفته می‌شود.

هنگامی‌که نتایج آزمایش بازیابی در محدوده قابل قبول نباشد می‌توان از روش‌های مختلقی برای تصحیح و بهینه سازی مجدد روش ایمونواسی استفاده نمود. به‌طور مثال:

1. بافر استفاده شده برای ساخت استاندارد را تغییر دهید. از یک بافر دیگر برای تهیه استانداردها استفاده کنید که ترکیب آن بیشتر با ماتریکس سرم مطابقت داشته باشد.
2. در ماتریکس سرم تغییر ایجاد کنید. به‌عنوان مثال، نمونه سرم را با استفاده از استاندارد صفر به نسبت 1:1 رقیق کنید. البته به این موضوع باید دقت شود که سطح آنالیت در نمونه رقیق شده به اندازه‌ای باشد که توسط کیت قابل تشخیص باشد. به بیان دیگر، غلظت نهایی پس از رقیق شدن باید از (LoD) Level of Detection  کیت بالاتر باشد (به مبحث حساسیت مراجعه نمایید).

کیت‌های الایزا و کمی‌لومینسنس آپتاسیس برای اندازه‌گیری آنالیت‌ها در نمونه سرم انسان – به‌عنوان رایج ترین نمونه بیولوژیکی - اعتبار سنجی شده‌اند. لازم به ذکر است که در بخش کنترل کیفیت کارخانه آپتاسیس برای ارزیابی اثر احتمالی ماتریکس و مداخله‌گر‌های موجود در سرم، تست بازیابی و خطی بودن برای همه کیت‌ها انجام می‌شود.